果蝇唾腺染色体标本的制备和观察研究

果蝇唾腺染色体标本的制备和观察研究

一、目的

1. 练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法。 

2. 观察了解果蝇唾腺学特征。 

二、原理 

本世纪初，D. Kostoff用压片法首先在D. melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾液腺染色体（salivary gland chromosome）。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。 

双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约1000～4000拷贝的染色体丝，合起来达5mm宽， 400mm长，比普通中期相染色体大得多（约100～150倍），所以又称为多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome）。 

唾液腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为2n=2×4，其中第II、第III染色体为中部着丝粒染色体，第IV和第I（X染色体）染色体为端着丝粒染色体（图21-1）。而唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起表成一染色中心（chromocenter），所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出6条配对的染色体臂，其5条为长臂，1条为紧靠染色中心的很短的臂（图21-2）。 

由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹（band）。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系，而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位，易位等，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。可见唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。 

三、实验材料 

黑腹果蝇三龄幼虫。 

四、器具和试剂 

双筒解剖镜、显微镜、镊子、小烧杯、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸。 

五、实验步骤 

1. 三龄幼虫的饲养 

黑腹果蝇容易饲养，也易获唾腺，但为获得理想的染色体制片标本，需要采用生长良好、形体肥大的三龄幼虫，以保证唾腺发育良好。所以饲养条件稍别于一般杂交饲养。 

（1）饲料要求松软，含水量较高，营养丰富，发酵良好。可采用下列配方： 

玉米粉100g、红糖130g、琼脂10g、酵母粉20g、苯甲酸0.75g、丙酸3ml、加蒸馏水1200ml。 

（2）在接种出现一龄幼虫后，将成虫移去，在饲料表面滴加低浓度的酵母液（2%～4.5%的水溶液），每天滴加1～2滴。2～3龄幼虫期适当增加酵母液浓度（10%左右）。滴加量以覆盖饲料表面一薄层为宜。 

（3）饲料营养对幼虫的发育固然重要，但幼虫密度过大亦会影响幼虫发育。故还需控制幼虫密度。这可通过控制成虫排卵时间来达到。一般情况下，牛奶瓶10对成虫交配后12小时左右将成虫转移。 

（4）稍低的温度有利于幼虫的充分生长发育，因而可采用15～18℃培养。 

2. 唾腺染色体制片 

（1）检查幼虫培养瓶，取一适龄幼虫，置于载玻片上，并加上一滴生理盐水（如幼虫带有饲料可先用生理盐水洗净），置双筒解剖镜下检查。首先熟悉幼虫结构，幼虫具一钝尾和带黑色口器的尖头端。 

（2）在解剖镜下用两支解剖针，一针压住头部，压点尽可能靠头部口器处。因为幼虫会蠕动，这一步需先练习几遍。 

（3）幼虫头部固定之后，再用另一针压住尾端（或用尖头镊子夹住），平稳快速一拉，使口器部分断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾腺也随之而出。唾腺是一对透明的香蕉状腺体，仔细观察可发现由一个个较大的唾腺细胞组成。 

（4）分离的腺体可能伴有消化道和脂肪体。在载玻片上再加一滴生理盐水，确定取得了腺体后，再用刀片或镊子仔细剔除这些杂物，仅让腺体留下。或将腺体吸到干净玻片上。 

(5）用滤纸将多余的生理盐水吸去，注意不要碰着腺体，以防吸走。然后滴一滴醋酸洋红，染色10分钟。 

（6）染色后，盖上盖玻片，用滤纸轻轻吸去多余染液，然后放平在桌面，用大拇指压下盖片，可横向揉几下（注意不要使盖片滑动，且只朝一个方向揉动，不要来回揉！），多练习几次，可望获得分散良好的制片。 

（7）制好的压片即可在显微镜下观察。亦可制成永久制片，步骤如下：置酒精：冰醋酸（3：1）固定液中固定，待盖片脱落后，再将有材料的载玻片和盖玻片通过下列顺序：95%酒精1分钟，纯酒精1分钟，再经纯酒精1分钟，取出载玻片，加一滴优巴拉尔（euparal）光学树胶，再取出盖玻片盖下，即可。 

六、实验结果 

检查你制作的制片，寻找形态良好、分散适中的图象仔细观察各条臂的特点。